زمینه و هدف: سم های عصبی کلستریدیوم آزادسازی نوروترانسمیترها را به وسیله پروتئولیز اختصاصی و انتخابی SNAP-25، سیناپتوبروین VAMP و سینتاکسین، مهار می کنند. پروتئین SNAP-25 یکی از پروتئین های تشکیل دهنده مجموعه لنگراندازی (Docking complex) در پایانه های عصبی است. این پروتئین سوبسترای سم عصبی بوتولینوم، سروتیپ های A، C و E می باشد. هر کدام از این سروتیپ ها به طور اختصاصی و در جایگاه ویژه SNAP-25 را در یک پیوند آمیدی برش داده و از تشکیل مجموعه لنگراندازی و در نهایت اگزوسیتوز نورترانسمیترها و انتقال پیام عصبی جلوگیری می کنند. در آزمایشگاه می توان با تولید SNAP-25 به روش نوترکیب از آن به عنوان سوبسترای سم، در تشخیص تیپ های E وA سم بوتولیسم بهره برد. روش بررسی: در این مطالعه بر آن شدیم که این پروتئین را به صورت نوترکیب تولید کنیم. برای این منظور cDNA ژن مورد نظر با استفاده از روش از RNA تام استخراج شده از سلول های مغز موش صحرایی تهیه و توسط RT-PCR تکثیر شد. محصول PCR روی ناقل pET32a همسانه سازی شد و پروتئین نوترکیب بیان شده به کمک روش وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتی بادی اختصاصی مورد تایید قرار گرفت و در نهایت با استفاده از یک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی (Ni-NTA) تخلیص و با کمک آنزیم اینتروکیناز فیوژن از پروتئین مورد نظر جدا شد. یافته ها: در این تحقیق شرایط بهینه برای بیان پروتئین نوترکیب SNAP-25، استفاده از غلظت یک میلی مولار IPTG، مدت زمان انکوباسیون 5 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد تعیین شد. در تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از ستون Ni-NTA، غلظت 250 میلی مولار ایمیدازول باعث جداسازی و تخلیص پروتئین نوترکیب شد. هم چنین استفاده از آنزیم اینتروکیناز برای برش فیوژن در دمای 37 درجه سانتی گراد نسبت به دمای محیط نتایج بهتری را به همراه داشت. نتیجه گیری: پروتئین نوترکیب تخلیص شده ساختار خود را در حین تخلیص از دست نداده و جهت برش و انجام آزمایشات بعدی مناسب و قابل استفاده می باشد. از آن جا که سایر روش های تشخیصی سم بوتولیسم از جمله روش استاندارد تزریق به موش بسیار وقت گیر می باشند لذا استفاده از این محصول نوترکیب به عنوان سوبسترا جهت تشخیص سم در آزمایشگاه می تواند تا اندازه ای مشکلات موجود در روش های قبلی را مرتفع سازد.

زمینه و هدف: زیر واحد بتای انتروتوکسین ویبریو کلرا بخش غیرسمی و پنتامریک محسوب می شود که این بخش مسوول اتصال هولوتوکسین به گیرنده گانگلیوزید GM1 واقع در سلول های هسته دار است. در این بررسی سعی شد زیر واحد بتای توکیسن ویبریوکلرا در سیستم پروکاریوتی تولید، تخلیص و تایید گردد.مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی ابتدا حامل نوترکیب زیر واحد بتای توکسین ویبریوکلرا pET-28a قابل القا در داخل سویه بیانی اشرشیاکلی (BL21) طراحی و ساخته شد. سپس سویه بیانی تحت تاثیر ایزوپروپیل- بتا- دی- تیوگالاکتو پیرانوزید القا و پروتئین نو ترکیب زیر واحد بتای توکسین ویبریوکلرا در مقیاس کوچک و بزرگ تولید شد. پروتئین نوترکیب تولید شده بااستفاده از ستون رزین نیکل پس از چند برابر شدن بدون آلودگی با زیر واحد A توکسین استخراج شد. در انتها پروتئین نوترکیب زیر واحد بتای توکسین ویبریوکلرا استخراج و تخلیص شده با آزمایش وسترن بلاتینگ تایید نهایی شد.یافته ها: میزان تخلیص پروتئین نوترکیب زیر واحد بتای توکسین ویبریوکلرا با این روش حدود 480 میکروگرم به ازای هر لیتر از محیط القا شده بود. آزمایش وسترن بلاتینگ نیز نشان داد پروتئین نوترکیب تخلیص شده به طور قوی و اختصاصی با آنتی بادی ضد انتروتوکسین ویبریو کلره واکنش می دهد.نتیجه گیری: اشرشیاکلی می تواند میزبان قابل دسترسی برای تولید پروتئین نوترکیب زیر واحد بتای توکسین ویبریوکلرا باشد. همچنین می توان از وکتور و میزبان طراحی شده برای تولید انبوه این پروتئین استفاده کرد.

زمینه و اهداف: سویه های پاتوژن سودوموناس آئروژینوزا پیلی قطبی تولید می کند که برای تحرک، چسبندگی و تهاجم مورد نیاز است. هدف از این مطالعه تولید و تخلیص پروتئین نوترکیب پیلین می باشد.مواد و روش ها: ژن کد کننده پیلین (pilA) از سویه PAO1 سودوموناس آئروژینوزا با بوسیله PCR جدا گردید و در وکتور بیانی pET-22b کلون شد. تایید ساختار وکتور نوترکیب به وسیله هضم آنزیمی دوگانه و تعیین توالی صورت گرفت. وکتور نوترکیب به داخلی باکتری (E.coli BL21(DE3 ترانسفورم شد و تخلیص پروتئین نوترکیب بوسیله کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. آزمون وسترن بلات با استفاده از توسط آنتی بادی ضد پلی هیستیدنی انجام شد.یافته ها: نتایج تعیین توالی و هضم آنزیمی صحت کلونینگ را تایید نمود. الکتروفورز پروتئین نشان داد که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب پیلین حدود 19 کیلودالتون می باشد. همچنین نتایج آزمون وسترن بلات تولید پروتین نوترکیب را تایید کرد. مقدار پروتئین تولید شده که به روش اسپکتروفتومتری مستقیم اندازه گیری شد که مقدار ان.2.58 میلی گرم به هر میلی لیتر تعیین شد.نتیجه گیری: نتایج وسترن بلات و الیزا به موازات نتایج تعیین توالی نشان دهنده صحت تولید پروتئین نوترکیب پیلین و حفظ ساختار نسبی آن می باشد.

زمینه: بروسلوز یکی از مهم ترین بیماری های زئونوز بوده که منجر به ضررهای اقتصادی فراوانی می شود. گونه بروسلا، باکتری های کوکوباسیل گرم منفی داخل سلولی هستند که قادر به تکثیر در فاگوزوم های ماکروفاژها می باشند و در بسیاری از گونه های حیوانی و انسان ها بیماری ایجاد می کنند. پیشگیری و تشخیص، هر دو لازمه ریشه کنی این بیماری می باشند. شناسایی و ارزیابی آنتی ژن های متفاوت سلول بروسلا در پیشبرد برنامه های پیشگیری و تشخیص نقش کلیدی دارند. در این تحقیق تولید و تخلیص پروتئین غشای خارجی 36 کیلو دالتونی نوترکیب (Omp2b) بروسلا آبورتوس به انجام رسید.مواد و روش ها: ژن پروتئین غشای خارجی 36 کیلو دالتونی بروسلا آبورتوس توسط آنزیم PrimeSTAR®HS DNA polymerase تقویت و در pJET1.2 کلون و ژن هدف در pET28a (+) ساب کلون شد. pET28a نوترکیب در E.coli BL21 (DE3) ترانسفورم شد. بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از 1 میلی مولار IPTG القا و پروتئین های حاصله توسط وسترن بلات بررسی شدند و Omp2b نوترکیب توسط آنتی سرم خرگوشی بروسلا ردیابی شدند.نتایج: ظهور باند قهوه ای- طلایی در جایگاه واکنش در وسترن بلات تاییدی بر کلون و بیان موفقیت آمیز بود. ما با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی، Omp2b نوترکیب را تخلیص کردیم که این روش پروتئین های ریفولد شده را بر روی ستون فراهم کرد.نتیجه گیری: Omp2b با موفقیت کلون، بیان و تخلیص شد. پروتئین های نوترکیب توسط آنتی سرم پلی کلونال شناسایی شدند که این امر صحت پروسه را تایید می کند.

هدف: پروتئین خارج غشایی omp در سطح خارجی پیکره باکتری عامل بیماری گرینینگ مرکبات (Candidatus Liberibacter asiaticus) وجود دارد. پروتئین مذکور می تواند به عنوان آنتی ژن برای تولید انواع آنتی بادی های مونوکلونال و پلی کلونال مورد استفاده قرار گیرد. با این حال خالص سازی پروتئین های غشایی به دلیل وجود ساختارهای آب گریز با مشکلات فراوانی همراه می باشد. در این راستا، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بهینه سازی استحصال و تخلیص پروتئین نوترکیب omp می باشد. مواد و روش ها: از سازه بیانی باکتریایی pET28a حاوی ژن omp برای تولید نوترکیب این پروتئین استفاده شد. بیان ژن omp در سویه Rosetta باکتری E. coli صورت پذیرفت. با توجه به آبگریز بودن پروتئین omp، خالص سازی آن در شرایط واسرشته مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از غلظت های مختلف سدیم کلراید، اوره و گوانیدین هیدروکلراید در شرایط اسیدی pH متفاوت استفاده گردید. به منظور دستیابی به پروتئین کاملا خالص نوترکیب، استحصال پروتئین از ژل پلی آکریل آمید با روش های مبتنی بر سونیکاسیون، شستشوی توسط انتشار و الکتروالوشن صورت پذیرفت. بررسی کمیت و کیفیت پروتئین های خالص شده با انجام الکتروفورز SDS-PAGE و محاسبه غلظت پروتئین با نرم افزار ImageJ انجام گرفت. همچنین برای تایید ماهیت پروتئین خالص شده، آزمون وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های اختصاصی صورت پذیرفت. نتایج: نتایج اولیه نشان داد که استفاده از غلظت 500 میلی مولار سدیم کلراید به عنوان یک جزء ضروری در بافرهای استخراج می باشد. همچنین استفاده از اوره به عنوان عامل دناتوره کننده کارایی دو برابری نسبت به گوانیدین هیدروکلراید در میزان پروتئین تخلیص شده داشت و بدین ترتیب بیشترین میزان پروتئین (450 میکروگرم در میلی لیتر) زمانی بدست آمد که غلظت 8 مولار اوره در اجزای بافری تخلیص گنجانده شد. علاوه بر این، نتایج مربوط به جداسازی باند پروتئین از ژل نشان داد که روش الکتروالوشن بهترین کارایی را در بازیابی و جداسازی پروتئین هدف از ماتریکس ژل در مقایسه با روش سونیکاسیون و شستشوی توسط انتشار داشت. نتایج آزمون الکتروفورز پروتئین حاکی از وجود یک پروتئین با اندازه 34 کیلو دالتون متناسب با وزن مولکولی پروتئین omp می باشد. آزمون وسترن بلات نیز موید ماهیت پروتئین نوترکیب در ممبران بود. نتیجه گیری: مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از اوره با غلظت 8 مولار، نمک سدیم کلراید با غلظت 500 میلی مولار به همراه تنظیم بافر الوشن روی (4) pH در مرحله تخلیص پروتئین می تواند به عنوان یک شرایط بهینه برای بدست آوردن بیشترین مقدار پروتئین هدف بکار رود. همچنین، روش الکتروالوشن به عنوان روش کارآمد جهت استحصال باند پروتئینی از روی ژل آکریل آمید معرفی شد.

مقدمه و هدف: سالمونلاها از مهمترین باکتریهای خانواده انتروباکتریاسه هستند که موجب عفونتهای سیستمیک در انسان و حیوانات میشوند. هدف از این مطالعه جداسازی و تایپینگ سالمونلاهای تیفوییدی با روش پلی اکریل آمید ژل الکتروفروزیس SDS-PAGE و مقایسه آن با روش سروتایپینگ میباشد.روش کار: در این مطالعه توصیفی - مقطعی تعداد یکصد مورد سالمونلا که از آزمایشگاههای مراکز درمانی شهر همدان جمع آوری شده بود به همراه 4 سویه رفرانس سالمولا و 5 سویه رفرانس دیگر از خانواده انتر و باکتریاسه مورد آزمایش قرار گرفتند. سروتایپینگ نمونه ها با آنتی سرمهای منووالان بیومریو و دیفکو انجام گرفت و الکتروفورز پروتیینهای ساختمانی آنها نیز در ژل 10% پلی آکریل آماید انجام گرفت. پس از رنگ آمیزی ژل ها با آبی کوماسی، اوزان مولکولی باندهای حاصل از الکتروفورز سویه های مورد مطالعه با استفاده از منحنی مربوط به باندهای حاصل از پروتیین های استاندارد مشخص گردید و توسط دستگاه دنسیتومتر مورد آنالیز قرار گرفتند.نتایج: از یکصد مورد سالمونلای جدا شده از بیماری 43 مورد (43%) مربوط به سالمونلاتیفی، 20 مورد (20%) سالمونلاتیفی موریوم، 12 مورد (12%) سالمونلاپاراتیفی B 10 مورد (10%) سالمونلاپاراتیفی C و یک مورد سالمونلاپاراتیفی A و بقیه نیز غیر تیفوییدی بودند. در روش الکتروفورز باندهای پروتئینی زیادی از مولکولهای بزرگ بیش از 220 کیلو دالتون (Kda) تا مولکولهای کوچک کمتر از 18.5 کیلو دالتون بدست آمد که به خوبی باعث تمایز سویه ها از یکدیگر گردید و براین اساس سالمونلا تیفی به 5 زیر گروه و سالمونلا پاراتیفی B و C هر کدام به 3 زیر گروه تقسیم شدند. همچنین الگوی پروتیینی سویه های رفرانس سالمونلا اختلاف عمده ای با الگوی پروتئینی سویه های رفرانس انتروباکتریاسه از خود نشان دادند. با این حال یک باند پروتئینی مشترک در ناحیه 43 کیلو دالتون در مقایسه با الگوی پروتئینی سویه های رفرانس انتروباکتریاسه مشاهده گردید.نتیجه نهایی: نتایج این مطالعه نشان داد که تخلیص پروتئینهای محلول در آب سالمونلاها به بکارگیری تکنیک SDS-PAGE میتواند بعنوان یک روش مطمئن تر از روش سروتاپینگ در طبقه بندی و تایپینگ این ارگانیسمها مورد استفاده قرار گیرد. با این حال تحقیقات بیشتری مورد نیاز است تا این روش بتواند جایگزین روشهای سروتایپینگ گردد.